生物指示劑（BIs）作為評估滅菌效果的關(guān)鍵工具，其最短培養(yǎng)時間（MIT）的測定長期面臨缺乏國-際-公-認方法的困境。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）雖試圖在設(shè)備和放射健康中心（CDRH）通過發(fā)布《生物指示劑培養(yǎng)時間驗證指南》提出了將縮短培養(yǎng)時間（RIT）至七天以下的方法，但由于缺乏實證支持，該方法未能得到廣泛應(yīng)用。為解決這一行業(yè)難題，2007年，國際標準化組織/技術(shù)委員會198（ISO/TC198）生物指示劑工作組啟動技術(shù)規(guī)范制定計劃，明確要求所制定的方法需通過同行評審驗證。

在此背景下，美國醫(yī)療器械促進協(xié)會于2008年成立特設(shè)委員會展開專項研究，其發(fā)表的兩項成果為MIT測定奠定了理論基礎(chǔ)。本文將詳細闡述基于這些成果提出的創(chuàng)新MIT測定方法。

一、最短培養(yǎng)時間（MIT）測定方法

本研究深入分析了10,000多種暴露于不同滅菌過程的生物指示劑的生長時間，研究范圍涵蓋多種生物指示劑配置，包括自含式生物指示劑和傳統(tǒng)孢子條，孢子載體選用紙和不銹鋼材質(zhì)。同時，選取嗜熱土芽孢桿菌和萎-縮芽孢桿菌這兩種最-常-用的細菌內(nèi)孢子作為研究對象。

科德角國際丨BI-O.K.™ 蒸汽滅菌自含式生物指示劑（左）

BI-O.K.™ 環(huán)氧乙烷自含式滅菌生物指示劑（右）

在實驗過程中，嚴格控制生長培養(yǎng)基，并選擇121℃、132℃、134℃和135℃的濕熱滅菌，以及環(huán)氧乙烷（EO）氣體、*（H2O2）蒸汽和二氧化氯（ClO2）氣體等多種滅菌工藝。這些滅菌工藝不僅是常用的滅菌手段，還具有不同的致死機制，如H2O2介導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移、烷基化和氧化等，從而確保了研究的全面性和代表性。

研究對不同組別的生物指示劑在以下三種條件下進行評估：

1、未暴露：作為對照組。

2、暴露于各種滅菌過程：使30%-80%的生物指示劑檢測結(jié)果為非無菌（即生長呈陽性）。在此條件下，部分生物指示劑無菌，部分非無菌，符合FDA CDRH協(xié)議的要求。

3、根據(jù)特定公式計算的時間暴露：

依據(jù)ISO11138-1、ISO14161和美國藥典中公布的計算存活時間（CST）公式確定暴露時間。

所有暴露后的細菌培養(yǎng)物均進行培養(yǎng)，直至觀察到非無菌結(jié)果，或最長培養(yǎng)7天，通過培養(yǎng)基渾濁、pH指示劑顏色變化等證據(jù)判斷非無菌結(jié)果。

二、關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：揭示生物指示劑生長規(guī)律

通過生長時間研究，獲得了一系列與確定最短培養(yǎng)時間（MIT）密切相關(guān)的重要發(fā)現(xiàn)：

1、無論滅菌過程類型、致死機制以及生物指示劑上的孢子種類如何，生物指示劑生長時間范圍近似正態(tài)分布。

2、暴露后的生物指示劑上存活孢子的數(shù)量與觀察到的生長時間呈反比。即存活孢子數(shù)量較多的生物指示劑，其生長時間相對較短；反之，存活孢子數(shù)量較少的生物指示劑，生長時間則較長。

3、約1.1%的生物指示出現(xiàn)生長時間延長現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在所有研究的滅菌過程中均有發(fā)生，且僅在滅菌暴露產(chǎn)生實驗區(qū)結(jié)果時才會發(fā)生。

4、在CST條件下暴露的生物指示劑無生長時間延長情況，且生長時間更快更穩(wěn)定。

三、舊方法局限：FDA CDRH協(xié)議的爭議

FDA CDRH協(xié)議難以被廣泛接受，主要原因在于缺乏測試結(jié)果來支持該方法及其接受標準。該協(xié)議要求進行三次滅菌暴露，每次使用100個生物指示劑，且需保證30%-80%的生物指示劑測試結(jié)果為非無菌；同時還規(guī)定縮短培養(yǎng)時間（RIT）與7天培養(yǎng)時間結(jié)果的相關(guān)性必須大于97%。然而，批評者認為，30%-80%的數(shù)值設(shè)定及相關(guān)性要求缺乏合理依據(jù)，國際社會普遍質(zhì)疑其選擇標準的科學性，但始終未有相關(guān)原理或測試結(jié)果能夠?qū)Υ诉M行證明。

從微生物暴露于滅菌過程的效應(yīng)來看，在僅有兩種可能結(jié)果（無菌或非無菌）的實驗條件下，部分生物指示劑可能僅有一個孢子存活，其他生物指示劑存活孢子數(shù)量較少。僅有一個孢子存活的生物指示劑，其孢子可能未受嚴重損壞或受到嚴重影響，這會導(dǎo)致生長時間的顯著差異。

根據(jù)泊松分布預(yù)測，當滅菌暴露使50%的生物指示劑為非無菌時，約35個生物指示劑僅有一個孢子存活，其余15個有兩個及以上孢子存活，且僅有一個存活孢子的生物指示劑生長時間大多處于較窄范圍，少數(shù)會出現(xiàn)生長時間延長。例如在濕熱和環(huán)氧乙烷滅菌過程中，分別僅有2/458（0.44%）和3/309（0.97%）個生物指示劑出現(xiàn)生長時間延長的情況。

當暴露條件導(dǎo)致的無菌比例較低時（如35%與75%相比），更易出現(xiàn)生長時間較長的生物指示劑。以35%的非無菌結(jié)果為例，每個暴露的生物指示劑平均存活孢子數(shù)為0.43，而75%非無菌結(jié)果時平均存活孢子數(shù)為1.39。隨著非無菌生物指示劑百分比降低，按比例來說，更多無菌生物指示劑將僅有一個有活力的孢子。因此采用CST計算所規(guī)定的暴露時間內(nèi)處理生物指示劑，使存活孢子數(shù)量保持在較低水平，是開發(fā)可行MIT方法的重要前提。

四、新方法：基于CST的MIT測定方案

基于先前研究測試結(jié)果及數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)提出確定生物指示劑最短培養(yǎng)時間（MIT）的新方法：

1、從三個批次中分別獲取至少100個由不同孢子作物生產(chǎn)的生物指示劑。

2、測定每個批次生物指示劑的D10值和孢子數(shù)量。

3、運用公式計算每批生物指示劑的存活時間（公式：CST=D10值×[log10初始孢子數(shù)-2]，單位：分鐘），該公式旨在使100%的生物指示劑檢測結(jié)果為非無菌。

4、在CST條件下，通過單獨的電阻計運行對每批生物指示劑進行暴露處理。

5、采用生物指示劑制造商指-定的回收方法（或指-定的生長培養(yǎng)基），并在規(guī)定的環(huán)境條件下操作。

6、持續(xù)培養(yǎng)，直至所有生物指示劑均檢測出非無菌結(jié)果，或培養(yǎng)時間達到7天（若7天后仍未檢測出非無菌，則需重新確認D10值和孢子總數(shù)）。

7、記錄所有生物指示劑的非無菌測試時間。

8、MIT為三個生物指示劑批次中出現(xiàn)非無菌結(jié)果的最長時間。

在確定CST時，建議使用Holcomb-Spearman-Karber（微生物破壞定量檢測數(shù)據(jù)分析方法）方法計算D10值。該方法利用一系列滅菌暴露中的所有分數(shù)陰性結(jié)果，計算“平均無菌時間"和相關(guān)的D10值。從統(tǒng)計學角度來看，這種方法計算出的D10值更有可能是最準確的，能夠提供最佳的D10值估計。

五、新方法：契合現(xiàn)代滅菌監(jiān)測需求

開發(fā)新的MIT測定方法需充分考慮滅菌過程監(jiān)測和控制方法的發(fā)展。早期濕熱滅菌器監(jiān)測手段有限，生物指示劑測試結(jié)果對確定滅菌工藝有效性至關(guān)重要。而如今，滅菌過程在工藝驗證框架下進行，現(xiàn)代滅菌器配備先進監(jiān)測和控制系統(tǒng)，生物指示劑檢測結(jié)果從屬于記錄的物理/化學結(jié)果，即便生物指示劑全部滅活，若物理/化學要求不滿足，滅菌過程仍判定為不合格。

大量實驗表明，未暴露與經(jīng)過滅菌處理的生物指示劑孢子萌發(fā)和生長動力學存在差異，未暴露的生長速度快、時間變化小，經(jīng)過滅菌處理的平均生長時間長、變化大。新提出的使用CST滅菌暴露的MIT方法，充分考慮了這種變異性，避免了“異常"結(jié)果的不當影響。相比之下，F(xiàn)DA CDRH方案中30-80%的存活率窗口存在問題，其縮短培養(yǎng)時間（RIT）的結(jié)果常受僅有單個孢子存活的生物指示劑異常結(jié)果主導(dǎo)，缺乏穩(wěn)健性和可重復(fù)性。

預(yù)計本文提出的MIT方法不會降低生物指示劑在監(jiān)測和控制滅菌過程中的有效性，反而能提供可重復(fù)確定生物指示劑生長時間的可靠方法為生物指示劑在現(xiàn)代滅菌監(jiān)測中的應(yīng)用提供更科學、準確的技術(shù)支持。